專家點評：厭氧氨氧化菌的富集培養是限制該工藝的關鍵因素，文章通過對照試驗考察了鐵離子對厭氧氨氧化污泥富集培養的影響，并采用定量PCR及16S rRNA高通量測序技術分析其機理，研究結果對厭氧氨氧化污泥的富集培養及工藝的啟動具有參考價值和指導意義。該文試驗數據充分，理論分析合理，撰寫規范，較好地表達了研究過程和結果，研究成果具有理論意義和實用價值。

本研究通過對照試驗考察了鐵離子對厭氧氨氧化污泥富集培養的影響，并采用熒光定量PCR及16S rRNA高通量測序技術從微生物生態學解析其機理，研究結果對厭氧氨氧化污泥的富集培養及工藝啟動具有參考價值和指導意義。

1材料與方法

1.1試驗裝置與運行條件

試驗采用小試規模厭氧顆粒污泥膨脹床反應器(expanded granular sludge bed, EGSB)，由有機玻璃制作，有效容積為0.8 L，外覆錫紙以隔絕光的影響。反應器運行溫度通過恒溫循環水槽維持在35 ℃，進水pH值用0.1 mmol/L鹽酸調節為6.6~6.8，以保證Fe(Ⅲ)的溶解;本試驗采用連續流，水力停留時間(HRT)為24 h，試驗裝置如圖1所示。

1.2接種污泥與模擬廢水

試驗所用接種污泥取自南京某市政污水廠氧化溝缺氧段，為棕黃色絮狀污泥。反應器接種污泥量為20 g/L，接種前用pH值= 7.2的磷酸鹽緩沖液沖洗三次，以洗去殘余物質。模擬廢水以自來水配置，組分為：(NH4)2SO4 (按需配制)、NaNO2 (按需配制)、KH2PO410 mg/L、CaCl2˙2H2O 5.6 mg/L、MgSO4˙7H2O 300 mg/L、KHCO3 500 mg/L、EDTA 25 mg/L、微量元素濃縮液Ⅰ 1.25 mL/L、微量元素濃縮液Ⅱ (按需配制)。微量元素濃縮液Ⅰ組分為：FeSO4 0.625 mL/L、H3BO4 0.0175 mL/L、MnCl2˙4H2O1.2375 mL/L、CuSO4˙5H2O 0.3125 mL/L、ZnSO4˙7H2O 0.5375 mL/L、NiCl2˙6H2O 0.2375 mL/L、NaSeO4˙10H2O 0.2625 mL/L、NaMoO4˙2H2O 0.275 mL/L。微量元素濃縮液Ⅱ：FeCl3 (按需配制)，R1為控制組，模擬廢水中不添加微量元素濃度液Ⅱ;而試驗組R2、R3中添加微量元素濃縮液Ⅱ并控制Fe(Ⅲ)濃度分別為0.04、0.08 mmol/L。模擬廢水預曝高純氮氣(> 99.5%)至溶解氧濃度(DO)低于0.5 mg/L，再泵入反應器中。

1.3常規指標分析方法

反應器出水定期采樣，經0.22 μm濾膜過濾后測定，分析測定方法參考國家標準。NH4+-N采用水楊酸分光光度法;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3--N采用酚二磺酸分光光度法;Fe(Ⅲ)采用鄰菲啰啉光光度法;溶解氧(DO)以便攜式溶解氧儀測定，pH值由pH計測定。

1.4污泥粒徑分析

從反應器中取一定量污泥至50 mL離心管中，置于激光粒度儀(Mastersizer 3000，英國馬爾文儀器有限公司)中檢測。樣品充分混勻后，以水為分散劑進行分析測試，并使用機器配置的軟件進行記錄，使用一次性塑料滴灌吸取攪拌均勻的樣品，污泥樣加至遮光度在10%~15%時進行測試。單一樣品重復測定三次，以降低誤差。

1.5實時熒光定量PCR分析

污泥樣品采用FastDNA SPIN Kit for soil試劑盒提取污泥DNA，而后用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計定量，采用SYBR® Green染料法進行定量PCR分析。選取目標基因包括：細菌16S rRNA基因、厭氧氨氧化菌16S rRNA基因及部分氮素轉化功能基因，以含有目標基因的質粒標準品建立標準曲線(R2 > 0.999)。擴增體系為25 μL，含12.5 μL 2 × SYBR® Green PCR Master Mix(Vazyme，中國)，2 μL模板DNA(20 ng/μL)，正反引物各0.2 μL，10.1 μL無菌超純水;擴增程序在熒光定量PCR儀AB7500(Life Technologies, 美國)進行，每個樣品做三個平行，具體參數如表1所示。

表1 目標基因的引物序列及退火溫度

1.616S rRNA高通量測序分析

16S rRNA高通量測序分析基于Illumina Miseq測序平臺，具體步驟包括DNA提取、PCR擴增、產物驗證及純化、測序及結果分析。DNA提取見1.5，PCR擴增采用細菌通用引物，引物序列為：正向引物(5’-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3’)，反向引物(5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’);擴增體系為50 μL，含5 μL 10×PCR Buffer (TaKaRa，日本)、0.25 μL Ex Taq DNA聚合酶、4 μL MgCl2、4 μL DNTP Mixture、2 μL DNA模板(20 ng/μL)、正反引物各1 μL，無菌超純水若干。擴增反應于Veriti PCR儀(Life Technologies，美國)進行，擴增程序為：預變性98 ℃/5 min，擴增循環20次(變性98 ℃/30 s，退火50 ℃/30 s，延伸72 ℃/40 s)，延伸72 ℃/10 min。擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，經E.Z.N.A.TM Cycle-Pure Kit試劑盒純化后，送至江蘇中宜金大分析檢測有限公司進行測序分析。測序數據使用Sickle和Mothur程序降噪處理，而后用RDP classifier對序列分類，使用Heml程序繪制熱圖

 

2結果與討論

2.1反應器運行性

能厭氧氨氧化污泥富集培養過程中，為考察鐵離子的影響，反應器保持同步容積氮負荷提升，直至運行穩定。反應器R1、R2、R3進出水氮素指標、容積氮負荷及氮去除速率如圖2所示。

圖2 鐵離子對厭氧氨氧化污泥富集培養過程中脫氮效能的影響

由圖2可知，富集培養初期(0~4 d)各反應器均出現菌體自溶現象，表現為出水NH4+-N濃度高于進水。由于進水中無有機碳源，且溶解氧濃度嚴格限制，導致部分微生物難以適應無機環境而自溶。在菌體自溶階段，反應器中存在強烈的內源反硝化作用，出水NO2--N及NO3--N濃度幾乎為0;此時反應器污泥顏色由黃棕變黑，并伴有明顯的減量。

隨著菌體自溶作用的減弱，反應器進入活性遲滯階段，表現出微弱的厭氧氨氧化作用。在此階段(5~38 d)，進水NH4+-N和NO2--N保持在45.1 mg/L和61.1 mg/L，各反應器運行并未表現出明顯差異。各反應器中出水NH4+-N濃度為24.6~42.6 mg/L，平均NH4+-N去除率為21.8%~26.7%，反應器出水NO2--N濃度較低，表明反應器中仍存在一定的反硝化作用。在此階段，各反應器逐漸適應環境，反硝化作用減弱，出水水質變化特征類似。

隨著反硝化功能的減弱，各反應器中厭氧氨氧化作用不斷增強，成為主要脫氮途徑，為活性提高階段。在此過程，各反應器進水容積氮負荷同步提升，由于鐵離子的添加，反應器表現出不同的容積氮負荷耐受能力。反應器R1活性提高階段為39~88 d，容積氮負荷由132.6 mg/(L˙d)提升至489.4 mg/(L˙d);R2在活性提高階段(39~100 d)容積氮負荷由132.6 mg/(L˙d)提升至580.9 mg/(L˙d);R3活性提高階段為39~112 d，容積氮負荷由132.6 mg/(L˙d)提升至696.6 mg/(L˙d)。容積氮負荷提升量由高到低為R3 > R2 > R1;此外，活性提高階段R1、R2、R3中平均總氮去除率分別為82.9%、84.2%、85.3%，試驗組R2、R3整體脫氮效率略高于R1。

在厭氧氨養護污泥富集培養中，由于厭氧氨氧化菌生長緩慢，反應器容積負荷有限。許多研究證明了高氮素基質對厭氧氨氧化菌的抑制作用。Strous等研究表明亞硝酸鹽濃度達到100 mg/L，即可強烈抑制厭氧氨氧化菌活性;本研究以出水亞硝酸鹽濃度高于100 mg/L作為反應器超過可承受負荷并失穩的依據。對照組R1在運行90 d時，容積氮負荷超出反應器承受極限，出水NH4+-N和NO2--N濃度急劇升高，類似失穩現象也出現在試驗組R2(第102 d)、R3(第114 d)。反應器失穩后，降低進水基質氮濃度，同時加大回流比以解除基質自抑制;由于EGSB反應器抗沖擊負荷能力強，反應器很快恢復穩定運行。穩定階段反應器運行狀況如表2所示。Chen等通過批次試驗證明了3.68 mg/L的鐵離子添加下，比厭氧氨氧化活性可提高533.2%;長期試驗證明，鐵離子的添加，相較于控制組，提升了19.5%的反應器容積負荷，與本研究結果類似。

表2 穩定階段反應器運行狀況

2.2污泥粒徑分布

本研究采用EGSB反應器培養厭氧氨氧化污泥，接種污泥為絮狀反硝化污泥，取接種污泥及130 d污泥樣品，用激光粒度儀分析其粒徑，結果如圖3所示。

富集培養130 d時，表觀觀察發現污泥呈顆粒化特征。激光粒度分析結果顯示，反應器R1、R2、R3中污泥樣品平均粒徑分別為796、908 μm和1040 μm，試驗組R2、R3中污泥粒徑較高。據DLVO理論，當負載電性相同的電荷時，由于細菌個體之間靜電斥力的存在，不利于顆粒狀富集培養物的形成。添加多價陽離子(Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+等)，可以減少細菌間的靜電斥力，通過壓縮雙電層促進細胞聚集，進而強化顆粒污泥富集。本試驗中，鐵離子的添加強化了厭氧氨氧化污泥的顆粒化;除減少細菌間靜電斥力作用外，鐵離子還是酶的常見活性劑，提高微生物代謝活性，促進微生物生長，加速厭氧氨氧化污泥的顆粒化。

2.3功能基因及厭氧氨氧化菌豐度變化

定量PCR結果顯示(圖4)，經過130 d的富集培養，各反應器微生物的量明顯提升，細菌16S rRNA拷貝數由初始的1.04×107copies/ng DNA 分別提高到1.34×107 copies/ng DNA (對照組R1)、2.73×107 copies/ng DNA(試驗組R2)和3.63×107copies/ng DNA (試驗組R3); R2、R3中豐度顯著高于R1 (p < 0.05)。由于進水中不含有機碳源，且嚴格限氧，反硝化微生物受到抑制，相關的功能基因napA (編碼周質硝酸鹽還原酶)、narG (編碼膜結合硝酸鹽還原酶)、nirK (編碼銅型亞硝酸還原酶)、nirS (編碼細胞色素cd1型亞硝酸還原酶)的豐度顯著降低。接種污泥中基因narG、napA、nirS、nirK豐度分別為1.01×106、3.16×105、4.71×106、1.01×107 copies/ng DNA，經過130 d的富集培養，其在反應器中豐度分別降至6.86×103 ~ 8.65×103、1.96×104 ~ 4.24×104、1.47×104 ~ 6.01×104、2.70×104 ~ 5.35×104copies/ng DNA，反應器R1、R2、R3間無顯著差異。此外，接種污泥中氨單加氧酶編碼基因amoA豐度為5.05×103 copies/ng DNA，富集培養130天后，反應器中amoA基因拷貝數為2.49 ~ 2.90×102 copies/ng DNA。

隨著污泥的富集培養，厭氧氨氧化成為反應器主要的脫氮途徑，相應的，厭氧氨氧化菌16S rRNA和功能基因hzsB豐度顯著增加。富集培養130 d后，R2、R3中Anammox 16S rRNA豐度分別為6.96×106、8.47×106 copies/ng DNA，顯著高于對照組R1中豐度(p < 0.05)。

聯氨合成酶為厭氧氨氧化菌的重要功能蛋白，其編碼基因hzsB豐度經富集培養過程也明顯提高;130 d時，對照組R1中hzsB豐度為6.83×106 copies/ng DNA，而試驗組R2、R3中其豐度分別為9.86×106、1.24×106 copies/ng DNA，顯著高于對照組R1(p < 0.05)。可以推測，鐵離子對厭氧氨氧化菌富集具有一定促進作用，同時提高了厭氧氨氧化活性，也與反應器脫氮效能結果一致。

2.4微生物群落結構變化

接種污泥及富集培養130 d后各反應器污泥微生物群落結構如圖5所示。接種污泥為反硝化污泥，由圖5(a)可見變形菌(Proteobacteria)和綠彎菌(Chloroflexi)為其優勢菌門，分別占比44.08%和19.11%;富集培養過程中微生物菌群結構顯著改變，Proteobacteria菌豐度分別降至31.72% (R1)、30.74% (R2)、30.52% (R3)。綠彎菌(Chloroflexi)相對豐度無明顯變化，而厭氧氨氧化菌所屬浮霉菌(Planctomycetes)豐度明顯提高，由接種污泥中的0.20%提高至5.10% (R1)、7.31% (R2)、9.54% (R3)，試驗組中富集程度較高。

圖5(b)為污泥微生物屬水平熱圖。可以看出，厭氧氨氧化菌Candidate Brocadia明顯富集;接種污泥中Candidate Brocadia菌難以檢測其豐度(< 0.01%)，經130 d的富集培養，對照組R1污泥樣品中厭氧氨氧化菌Candidate Brocadia相對豐度為4.2%，而試驗組R2、R3污泥樣品中其豐度分別為6.8%、8.2%，高于對照組R1。

3結論

(1)進水添加鐵離子富集培養厭氧氨氧化污泥過程中，試驗組R2、R3與對照組R1中呈現類似的規律性，而試驗組可承受容積氮負荷顯著高于對照組。穩定階段，試驗組R2、R3容積氮去除速率分別為495.6、602.4 mg-N/(L˙d)，為對照組R1的1.20和1.46倍。進水添加鐵離子提高了反應器容積氮負荷及運行效能。

(2)進水添加鐵離子富集培養厭氧氨氧化污泥130 d后，污泥群落結構及功能基因豐度顯著變化。反硝化功能基因narG、napA、nirS、nirK豐度顯著降低，厭氧氨氧化菌及微生物量富集明顯。試驗組R2、R3中厭氧氨氧化菌Candidate Brocadia相對豐度為6.8%、8.2%，明顯高于對照組R1(4.2%)。

原標題:凈水技術|鐵離子對厭氧氨氧化污泥富集培養的影響